VIB onderzoek verbetert techniek om eiwitten te bestuderen
Nieuw 'microvloeistofapparaat' verbetert de resolutie van de trEM techniek met factor tien
Brussel, 18 augustus 2023 – Time-resolved cryo-elektronenmicroscopie (trEM) is een methode om te visualiseren hoe eiwitten in de tijd functioneren met bijna atomaire resolutie. Hoewel deze methode in 1990 werd ontwikkeld, is het potentieel van deze techniek onbenut gebleven vanwege twee knelpunten. Een daarvan is dat de techniek teveel eiwitten opgebruikt, en de andere is dat de tijdresolutie te laag is. Onderzoekers van het labo van prof. Rouslan Efremov van het VIB-VUB Centrum voor Structurele Biologie ontwikkelden een microvloeistofapparaat dat beide problemen aanpakt. Hun resultaten werden gepubliceerd in Nature Methods.
De uitdagingen van het bestuderen van de eiwitfunctie
Het reconstrueren van de exacte werking van eiwitten is een uitdaging. Eiwit-gerelateerde fenomenen zoals ligandbinding, eiwit-eiwitinteracties en ladingsuitwisseling zijn dynamische processen die in een zeer kort tijdsbestek plaatsvinden. Dit maakt het moeilijk om de complexe conformationele overgangen – veranderingen in vorm die cruciaal zijn voor het functioneren – van eiwitten in detail te bestuderen.
Time-resolved cryo-elektronenmicroscopie (trEM) is een techniek die eiwitmechanismen helpt ontrafelen door de structuur van eiwitten te visualiseren terwijl ze hun werk aan het doen zijn. De eerste stap van trEM is het initiëren van de reactie door ‘flits fotolyse’ of mengen, gevolgd door het stoppen van de eiwitreacties op opeenvolgende tijdstippen door ze te bevriezen. Hoewel trEM een techniek met een groot potentieel is, hebben de huidige benaderingen hun grenzen. De tijdsresolutie voor het vriezen is beperkt tot 100 ms of de hoeveelheid verbruikt eiwit is erg hoog, waardoor de techniek moeilijk toepasbaar is in de praktijk.
Het labo van prof. Rouslan Efremov van VIB-VUB Centrum voor Structurele Biologie heeft nu een instrument ontwikkeld dat deze knelpunten aanpakt.
Het trEM-potentieel waarmaken
Het team ontwikkelde een microvloeistofapparaat dat een snelle mixer en een spraygenerator combineert. Het kapselt eiwitten in kleine druppeltjes in waar de reactie wordt geïnitieerd door snel mengen, en vervolgens gebruikt het een laser om kleine belletjes te creëren die helpen om de monsters op roosters te spuiten die kunnen worden gebruikt voor beeldvorming.
Dr. Stefania Torino, eerste auteur van de studie: "Het precieze mengen en spuiten van de kleine druppeltjes die de eiwitten bevatten, pakt de knelpunten aan – zowel de hoeveelheid eiwit die nodig is als de tijdsresolutie – die andere benaderingen limiteren."
De onderzoekers testten het apparaat om de dynamiek van het GroEL:GroES-eiwitcomplex te bestuderen. Deze eiwitten spelen een belangrijke rol bij het goed vouwen van andere eiwitten, een zeer dynamisch proces. Met behulp van hun nieuw ontwikkelde microvloeistofapparaat kon het team met succes de eiwitmonsters bestuderen met een tijdsresolutie van 5 ms terwijl het minder dan 100 nL eiwitoplossing per EM-raster verbruikte. Dit is een enorme, bijna tienvoudige verbetering ten opzichte van de eerdere trEM-technologieën.
"Ons nieuwe apparaat maakt trEM-monstervoorbereiding mogelijk toepasbaar voor schaarse eiwitten," zegt prof. Efremov. “Het werk houdt hier niet op. We stellen ons voor dat we met verdere technische verbeteringen aan onze opstelling een tijdresolutie van minder dan 1 ms zullen bereiken.”
Publicatie
Torino et al. Time-resolved cryo-EM using a combination of droplet microfluidics with on-demand jetting. Nature Methods, 2023.
